EXPERIÊNCIA No.1: EXTRAÇÃO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli.
Protocolo:
Será utilizada uma cultura de bactérias E.coli que foi inoculada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37êC até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para geladeira.
1. Coletar as bactérias pela centrifugação de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel absorvente. Balancear os tubos!
2. Adicionar 6mL da solução I (citrato de sódio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactérias por inversão.
3. Remover a tampa e adicionar 0,7mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (P/V)]. Fechar o tubo e incubá-lo em banho-maria a 60êC por 10 min, com agitação manual suave.
4. Retirar o tubo do banho, abrir e deixá-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume (6,7mL) da solução III (Clorofórmio:alcool isoamílico 24:1 V/V). Não pipetar com a boca! Fechar muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min a temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada na capela de exaustão.
5. Centrifugar 5 min a 5000 rpm.
6. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma proveta. Estimar o volume e transferir para um cálice graduado.
7. Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20êC e adicioná-lo lentamente com pipeta Pasteur, pela parede do cálice.
8. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transferí-lo para um tubo de ensaio contendo 10mL de Solução IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20min, até completa dissolução.
9. Identificar o tubo com o número do grupo. Tomar uma alíquota e diluir em 1 ml de água. Medir a D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relação D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida assumindo que D.O.260nm (Densidade Óptica a 260nm) = 1 equivale a 50∫g DNA/mL.

RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.1Grupo No. Data
Nome dos Alunos:
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4-5 -
OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________
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QUESTÕES:
1. Qual a função do SDS, Clorofórmio:Isoamílico e Etanol nas etapas da purificação? Consultar tabela no roteiro de aulas práticas. 2. Por que é possível "enrolar" o DNA no bastão de vidro?
3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experiência realizada.
4. Se compararmos as medidas de absorção a 260 nm e a 280 nm da amostra de DNA obtida e de uma solução de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactérias, o que observaríamos? Por que?
5. Como você faria para obter DNA puro a partir dessa preparação que contém DNA e RNA?
6. Por que ocorre o efeito hipercrômico na desnaturação do DNA?