EXPERIÊNCIA N^o. 3: DIGESTÃO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ANALISADA EM ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE

A partir da preparação de DNA plasmidial obtida na prática 3 de bactérias previamente transformadas com um plasmídio como descrito na prática 1.

Digestão com enzimas de restrição e análise dos produtos da digestão através de eletroforese em gel de agarose.

1. O sedimento seco sob vácuo em "speed vac" foi ressuspenso em 25m l de T.E. (Esta etapa foi realizada pelos monitores em um dos laboratórios de pesquisa do IQ-USP)
2. Incubar por 5 min a 65^oC.
3. Tomar um volume apropriado da solução de plasmídeos e adicionar tampão de amostra na proporção 1:10.
4. Aplicar a amostra em gel 0.8% agarose em TBE como descrito adiante.

Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digestão com enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA. A escolha das enzimas de restrição deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterização do DNA em questão, ou seja, obter seu mapa físico. As enzimas de restrição comercialmente disponíveis em geral vem acompanhadas do tampão correspondente e instruções para realizar a reação.

Na experiência a ser realizada o DNA plasmidial será digerido com 4 enzimas de restrição diferentes combinadas ou não

- Cada grupo (ver tabela abaixo) receberá um tubo Eppendorf contendo os componentes da reação com exceção do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo.

Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8,

NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8,

MgCl₂ 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v

DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v

*(depende da enzima) sacarose 40% p/v

1. Pesar 0,8 g de agarose. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH8).
2. Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose. Enquanto espera-se a dissolução da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar até 40° C (até conseguir segurar com as mãos) e acrescentar 5m L de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL.

1. Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente. Deixar solidificar por pelo menos 30min.
2. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possível.
3. Aplicar as amostras preparadas nas duas experiências anteriores. Aplicar o marcador de tamanho em uma das canaletas. Anotar a ordem de aplicação das amostras no gel.
4. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar aproximadamente 100V.

Cuidado para não tocar o tampão.

5. Interromper a eletroforese quando o corante azul de bromofenol estiver a 0,5cm do fim do gel. O corante xileno-cianol mostra coloração esverdeada.
6. Transferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando óculos protetores. Fotografar o gel com câmera polaroide.

RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA N^o.4

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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________

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QUESTÕES:

2. Quantas bandas do DNA plasmidial purificado na parte A são vizualizadas no gel corado com EtBr? Por que?

3. Géis de agarose podem ser usados para análise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 a 800.000 pares de base. Assim, é possível estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relação a de outros de tamanho conhecido. O gráfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dará uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relação a uma determinada mobilidade. Entretanto, a interpolação é muito mais precisa se a função puder ser encontrada em uma linha reta: gráfico de log L versus M. A partir da fotografia do gel mostrada abaixo, desenhe uma reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em pb) a partir do tamanho dos padrões de tamanho em pb. Calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digestão do plasmído (pVET) com as enzimas indicadas e desenhe no mapa a posição relativa destes sítios de clivagem.