Tópicos Aula 9
Tecnologia do DNA recombinante
Passo-a-passo do processo de clonagem
- digestão do DNA com enzimas de restrição e isolamento do fragmento de DNA a ser clonado
- digestão do vetor com uma enzima de restrição compatível
- ligação
- transformação de células hospedeiras (E. coli, levedura, células de mamífero em cultura)
- seleção dos transformantes
Enzimas de restrição (atividade, sítios reconhecidos, conceito de sequência palindrômica, produto da reação)
DNA ligase
Vetor de clonagem (elementos, estrutura, sítio multiplo de clonagem, cassete de seleção)
Principios da Transformação de bactérias
Detecção e análise de ácidos nucléicos
- eletroforese em gel de agarose
- determinação do mapa de restrição
- transferência de DNA e RNA para membranas (southern e northern blot)
- produção de sondas radioativas
- hibridização
- microarrays de DNA
- construção de bibliotecas gênicas
(biblioteca genômica, biblioteca de cDNA, vetores plasmidiais e bacteriófagos)
- varredura de bibliotecas com sondas radioativas para identificação de genes de interesse
- sequenciamento de genes e genomas (método de Sanger com nucleotídeos radioativos e fluorescentes)
- vetores de expressão e varredura de bibliotecas de expressão com anticorpos
- Bioinformática - Alguns principios da análise de genes e genomas
Mutagênese sítio dirigida
Expressão de proteínas recombinantes (usos e exemplos)
Obtenção de camundongos e plantas transgênicas
Clonagem de animais
Células tronco